Realice un seguimiento de la endocitosis y el transporte de proteínas con Quantum Dots

Realice un seguimiento de la endocitosis y el transporte de proteínas con Quantum Dots


A pesar de las ventajas de la tecnología de visualización de células de mamíferos, algunas propiedades de las proteínas mostradas, como su mecanismo de reingreso a la célula, siguen sin estar claras. En un artículo reciente en la revista Química analíticalos autores presentan una descripción general del mecanismo de endocitosis, el comportamiento de la motilidad y la cinética de transporte de la proteína mostrada utilizando HaloTag como proteína mostrada y seguimiento de partículas individuales basado en puntos cuánticos.

Aprender: Los puntos cuánticos rastrean la endocitosis y el transporte de proteínas que muestran las células de mamíferos. Crédito: Van Pympk/Shutterstock.com

Seguimiento de proteínas de visualización

La tecnología de visualización de células de mamíferos tiene el potencial de inducir el plegamiento de proteínas y facilitar varias funciones relacionadas con el procesamiento postraduccional. Por lo tanto, los productos obtenidos imitan de cerca las moléculas de proteínas biológicas naturales desde su estructura molecular hasta sus funciones biológicas. Sin embargo, los problemas centrales del mecanismo de reentrada de células de proteínas de visualización mediante la tecnología de visualización de células de mamíferos siguen sin estar claros, lo que limita su aplicación generalizada.

Los procesos dinámicos en los sistemas biológicos se pueden estudiar con el seguimiento de partículas individuales. Es una técnica de microscopía utilizada para visualizar la trayectoria de una sola partícula. Las biomoléculas rastreadas están marcadas con fluorescencia, lo que permite su seguimiento in situ a largo plazo.

Debido a las propiedades ópticas únicas de los puntos cuánticos (QD), tienen ventajas en las imágenes de fluorescencia. La sensibilidad de detección de QD aumentó con la alta intensidad de fluorescencia, lo que permitió imágenes de contraste. Además, la fotoestabilidad de los QD facilita su seguimiento a largo plazo.

Microscopía electrónica de transmisión (A) y estadísticas de tamaño de partículas (B) de puntos cuánticos solubles en aceite.  (escala: 50nm)

Microscopía electrónica de transmisión (A) y estadísticas de tamaño de partículas (B) de puntos cuánticos solubles en aceite. (Escala: 50 nm). Crédito de la imagen: Zhang, MQ et al., Química analítica

QD etiquetados HaloTags como proteínas mostradas

En el presente trabajo, los autores insertaron HaloTag en la pantalla del vector de expresión y lo mostraron en la superficie celular. El HaloTag introducido se une específicamente a los ligandos derivados del halo a través de un enlace covalente. Además, las HaloTags se marcaron con fluorescencia con QD.

Mediante el seguimiento de una sola partícula de los QD, los autores descubrieron que HaloTag no se adhiere a la membrana celular, sino que se absorbe en la célula de manera dependiente de la temperatura y el tiempo. Los autores investigaron el mecanismo de la endocitosis de HaloTag combinando los experimentos de mutación negativa dominante con células tratadas con inhibidores. Los resultados mostraron que la entrada de HaloTag en las células se produce a través de la endocitosis mediada por clatrina.

Los autores analizaron las trayectorias de movimiento del HaloTag etiquetado con QD y los resultados mostraron que el transporte de HaloTag ocurre en tres fases. Mediante estudios de colonización, los autores confirmaron la agregación de HaloTag en los lisosomas. Los datos en tiempo real mostraron el transporte de HaloTag a lo largo del citoesqueleto.

El tamaño hidrodinámico fue de 8,6 ± 0,3 nm para OPA-QD, 14,5 ± 0,4 nm para NH2-QD y 16,8 ± 0,3 nm para HTL-QD.  (Se repitió una muestra tres veces)

El tamaño hidrodinámico fue de 8,6 ± 0,3 nm para OPA-QD, 14,5 ± 0,4 nm para NH2-QD y 16,8 ± 0,3 nm para HTL-QD. (Se repitió una muestra tres veces). Crédito de la imagen: Zhang, MQ et al., Química analítica

resultados del estudio

Los autores realizaron una encapsulación hidrofóbica para obtener QD solubles en agua sin alterar la propiedad de fluorescencia o los grupos funcionales en los QD. De esta manera, los QD preparados se transfirieron a la fase acuosa sin afectar las propiedades ópticas. La modificación de los QDs con polietilenglicol (PEG) aumentó la especificidad en la adsorción de los materiales e introdujo los grupos amino en la superficie de los QDs para la posterior reacción con los succinimidil ésteres.

Los resultados de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron que los QD hidrofóbicos tenían un tamaño de partícula promedio de 5,6 nanómetros. Otros resultados de dispersión de luz dinámica (DLS) mostraron que los QD solubles en agua (OPA-QD) tenían un tamaño hidrodinámico de 8,6 nanómetros y su modificación con PEG y funcionalización con ligandos HaloTag aumentaron su tamaño a 16,8 nanómetros.

El potencial zeta de los OPA-QD, modificados con amino (NH2)-QD y puntos cuánticos funcionalizados con ligando HaloTag (HTL-QD) fueron -38,7 milivoltios, -17,1 milivoltios y -20,4 milivoltios, respectivamente. Esta variación del potencial zeta se debe a que el PEG aumenta el potencial superficial en el primer caso. En el segundo caso, la reacción entre el grupo amino y el éster de succinimida redujo el potencial superficial. Además, la movilidad electroforética estaba en el orden: HTL-QDs > NH2-QDs > OPA-QDs. Los resultados de la fluorescencia indicaron que la unión de los QD a las células HaloTag MDCK se produjo a través de enlaces covalentes.

La incubación de HTL-QD con células de riñón canino Martin-Darby (MDCK) a 37 grados centígrados durante 0,5 h reveló señales colonizadas de QD y colorante de membrana (DiO) en el citoplasma, lo que indica la internalización de HaloTag por las células. Con el aumento del tiempo de incubación, la fluorescencia de QD en el citoplasma aumentó y la señal de DiO los colocó, lo que indica el atrapamiento de QD-HaloTag en los endosomas nucleares. Los autores confirmaron que los QD se acumularon cerca del núcleo y no siempre lo invadieron.

Para verificar la endocitosis mediada por clatrina de las proteínas mostradas, los autores observaron la internalización de QDs-HaloTag después de la sobreexpresión de AP180C en las células, y los resultados mostraron que la captación de HaloTag mostrada estaba bloqueada en las células sobreexpresadas con AP180C.

Incubación de células MDCK con diferentes proporciones de puntos cuánticos modificados con ligando HaloTag.  (escala: 10 µm)

Incubación de células MDCK con diferentes proporciones de puntos cuánticos modificados con ligando HaloTag. (Barra de escala: 10 μm). Crédito de la imagen: Zhang, MQ et al., Química analítica

Conclusión

En este estudio, los autores etiquetaron HaloTag en la superficie de la célula MDCK con HTL-QD e investigaron la endocitosis y el transporte postendocítico de la proteína de visualización utilizando células vivas. Los autores encontraron que el bloqueo de la captación de HaloTag inhibía la función de la clatrina, lo que sugiere la entrada de HaloTag mediada por claritina. Los estudios en tiempo real mostraron el movimiento de las proteínas mostradas a lo largo de los microtúbulos y microfilamentos. Los resultados de la investigación mostraron que los procesos intracelulares, como la internalización y el reciclaje, determinaron la cantidad total de proteínas dinámicas en la superficie celular.

fuente

Zhang, MQ, Wang, ZG, Fu, DD, Zhang, JM, Liu, HY, Liu, SL y Pang, DW Puntos cuánticos que rastrean la endocitosis y el transporte de proteínas que muestran las células de mamíferos (2022). Química analítica. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c00411

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