Optimización de la cuantificación de la cinética de unión proteína-proteína

Optimización de la cuantificación de la cinética de unión proteína-proteína


La separación de proteínas de medios complejos utilizando nanopartículas magnéticas requiere pasos adicionales para cuantificar las proteínas unidas a las nanopartículas. En un artículo reciente publicado en el Journal of The Electrochemical Society, los autores simplificaron la cuantificación de la cinética de unión de proteínas sin necesidad de pasos de elución o inmovilización. ​​​​​​

Optimización de la cuantificación de la cinética de unión proteína-proteína

Estudio: seguimiento de nanopartículas magnéticas para la separación de proteínas y el análisis de la cinética de unión en un solo paso. Crédito de la foto: Volodymyr Dvornyk/Shutterstock.com

Cuantificación de la cinética de unión a proteínas.

La cuantificación de la cinética de interacción de proteínas es fundamental para el desarrollo de biosensores, biomarcadores para la detección de enfermedades, la comprensión de los mecanismos biológicos y la identificación de candidatos a fármacos. Los métodos sin etiquetas, como la resonancia de plasmones superficiales (SPR), requieren la introducción de ligandos de unión a superficies de sensores funcionalizados instalados con sistemas de microfluidos difíciles de mantener. Además, este proceso implica la inmovilización de proteínas unidas a la superficie del sensor mediante química de conjugación y bloqueo.

Las proteínas purificadas se obtienen mediante separación por afinidad, como con las nanopartículas magnéticas. Al hacerlo, las proteínas son capturadas por nanopartículas cuya superficie es modificada por sondas de afinidad. Es un proceso largo que implica la elución de proteínas y el intercambio de tampones. Por lo tanto, el proceso de purificación de proteínas debe simplificarse.

Medir el tamaño de las nanopartículas unidas a moléculas es un desafío debido a su pequeño tamaño. Los métodos novedosos, como los detectores de dispositivos acoplados cargados (CCD) y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), han superado al método de dispersión de luz dinámica (DLS) en el análisis de la variación de tamaño de las nanopartículas individuales.

Nuevo método para la purificación y el análisis de proteínas

En el presente trabajo, los autores presentaron un nuevo método basado en NTA para cuantificar la cinética de unión a proteínas para las proteínas atrapadas en las nanopartículas magnéticas.

La ventaja de este método es que puede eliminar la necesidad de elución de proteínas de las nanopartículas o la inmovilización en la superficie del sensor. Se siguió ópticamente el cambio en el tamaño de las nanopartículas tras la unión del ligando. El enfoque actual es un método novedoso que hace que la purificación de proteínas y el análisis posterior sean un proceso simple.

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principio de detección (a) Protocolos que muestran la captura de proteínas en las partículas magnéticas (pasos 1-3) y la detección posterior de la unión del ligando (pasos 4-7). Después de agregar el ligando (Paso 4), se transfirió inmediatamente un pequeño volumen de la mezcla a un capilar montado en la configuración de imágenes para monitorear el movimiento de las partículas. (b) Configuración óptica para el seguimiento de partículas. La luz incidente se enfoca en el capilar y se refleja la luz dispersada lateralmente de las partículas. (c) Una ampliación del capilar que muestra el área de la imagen (izquierda) y una imagen que muestra la luz dispersada por las partículas (centro). Las partículas se rastrean y el radio hidrodinámico se extrae de miles de partículas (derecha). © Zhao, Y., Ma, G. y Wang, S. (2022).

resultados del estudio

La medición única para determinar el tamaño de partícula integra una amplia dispersión que influye en la precisión y exactitud. La distribución se ajusta a una ecuación gaussiana con desviación estándar σ y media r. Además, los valores de σ y r fueron diferentes para cada medición.

Los autores discutieron la ampliación del pico y las posibles variaciones de la medición. Dado que no se pierde información de movimiento browniano al reducir la dimensión, realizaron una simulación de Monte Carlo en el modelo unidimensional.

En la simulación, los autores examinaron cuatro parámetros: distribución del tamaño de las partículas, distribución de la duración del seguimiento, número de pistas de cada partícula y número de partículas. Los estudios comenzaron con un caso simple y la mayor complejidad en los escenarios imita las condiciones experimentales.

Los resultados mostraron que el recuento de partículas y la duración de la traza tienen un gran impacto en la precisión y la exactitud. Las pistas apropiadas redujeron la varianza y mejoraron la precisión, y el aumento del tiempo de seguimiento redujo el error de ajuste y mejoró la precisión.

Los autores consideraron que la segunda fuente de ruido son las huellas falsas, que son causadas por impurezas y aditivos e influyen en la calidad del pasaporte. Además, las pistas falsas producen información de tamaño inexacta debido a la información de pista corta y las intensidades de imagen parpadeantes. El flujo inducido por el calentamiento por láser fue la tercera fuente de ruido que hizo que las partículas se desplazaran.

El desplazamiento cuadrático medio (MSD) contenía información de deriva y movimiento browniano, y la deriva aumenta el valor de MSD y disminuye el tamaño hidrodinámico. Asimismo, un aumento de la temperatura aumenta la MSD.

Medición del tamaño de partícula y afinidad de unión al ligando. (a) Seguimiento del movimiento de una sola partícula. El punto brillante en el círculo naranja es la partícula y se rastrea su movimiento dentro de los 5,2 s (trazo rojo). ( b ) Histograma que muestra la distribución del diámetro obtenida a partir de la traza de> 2000 partículas. (c) Se añade anti-BSA a las partículas recubiertas con BSA y la unión aumenta el tamaño de las partículas. ( d ) Diámetro hidrodinámico de las partículas en función de la concentración de anti-BSA en equilibrio. El recuadro muestra el trazado de los datos en una escala logarítmica, con la curva punteada roja que representa el ajuste de los datos a la ecuación. 2. Las barras de error representan la desviación estándar de >2000 partículas individuales. © Zhao, Y., Ma, G. y Wang, S. (2022).

El presente método puede cuantificar la cinética de unión de anticuerpos a concentraciones que abarcan el rango en inmunoensayos. Mientras que el límite de concentración superior se debe a la concentración de partículas debido a un seguimiento incorrecto, el límite inferior se debe al tamaño de la molécula y la afinidad de unión. Para medir la cinética de unión y el rango dinámico, las partículas se mezclaron con el ligando y se cargaron en un capilar desde un tubo de centrífuga. La mezcla y sedimentación de la muestra después de la carga tomó aproximadamente dos minutos. Cálculos posteriores permitieron a los autores estudiar las posibilidades de ampliar el rango dinámico.

Además, la reducción del tiempo de preparación de dos minutos a un segundo ha duplicado el rango medible. La disminución de σ al 0,1% amplió el rango medible dos veces y cubrió todas las interacciones moleculares. Aquí, el dispositivo de microfluidos redujo el tiempo de preparación, lo que permitió una mezcla rápida y un flujo controlado.

El aumento del recuento de partículas redujo el ruido. Aunque el ruido era un problema estadístico, el seguimiento de las partículas a lo largo del tiempo superó este problema.

Conclusión

En el presente trabajo, los autores cuantificaron la interacción proteína-proteína utilizando un nuevo método de seguimiento de partículas. Este enfoque permite extraer proteínas para su posterior separación utilizando nanopartículas magnéticas. Además, la medición de la cinética de unión a proteínas no incluyó elución ni inmovilización.

Los autores anticipan que el presente método puede agilizar el proceso de purificación y análisis de proteínas, acelerando la investigación de proteínas.

referencia

Zhao Y, Ma G y Wang S (2022). Seguimiento de nanopartículas magnéticas para la separación de proteínas y el análisis de la cinética de unión en un solo paso. Revista de la Sociedad Electroquímica. https://iopscience.iop.org/article/10.1149/1945-7111/ac6bc5

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