Método «Plug-and-play» para la administración de proteínas intracelulares

Método «Plug-and-play» para la administración de proteínas intracelulares


Un nuevo artículo de ACS Nano demostró la viabilidad de utilizar una matriz modular de biotina-estreptavidina de nanocompuestos para el suministro intracelular de proteínas citosólicas.

Los científicos desarrollan un método

Estudio: Suministro de proteínas citosólicas mediante el ensamblaje modular de biotina-estreptavidina de nanocompuestos. Crédito de la foto: Design_Cells/Shutterstock.com

Importancia y desafíos de la entrega de proteínas intracelulares

La administración intracelular de proteínas representa una tecnología revolucionaria para la investigación básica y las aplicaciones biomédicas. Las proteínas desempeñan un papel crucial en la homeostasis y la transducción de señales celulares. Además, varias enfermedades hereditarias son causadas por funciones proteicas anormales.

Aunque hay más de 130 productos terapéuticos de proteínas aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en el mercado, la eficacia de estos productos terapéuticos se ha limitado a objetivos extracelulares debido a la impermeabilidad de su membrana celular.

Para lograr el suministro de proteínas citosólicas, las estrategias requieren acceso a objetivos intracelulares como el núcleo y los orgánulos subcelulares. Una proporción significativa de los enfoques de administración de proteínas intracelulares existentes depende de la captación endosomal de nanovectores o proteínas modificadas.

El atrapamiento endosomal de proteínas puede limitar gravemente la eficacia de las estrategias de administración intracelular al impedir el acceso al citosol. Además, la carga de proteína atrapada en los endosomas con frecuencia se degrada o exocitosa a través de la vía liso/endosomal, lo que hace que la endocitosis sea una vía desafiante para el suministro intracelular de proteínas.

Posibles formas de lograr la entrega de proteínas intracelulares

Por lo general, menos del diez por ciento de la proteína endocitada escapa al citosol a través de los enfoques de administración existentes, lo que puede incrementarse mediante el desarrollo de vehículos de administración que puedan inducir la ruptura endosomal y facilitar el escape de la proteína al citosol. La fusión de vectores de transporte de proteínas a la membrana celular puede proporcionar un mecanismo directo de suministro intracelular, eludiendo los problemas asociados con el atrapamiento endosómico.

Las plataformas de entrega versátiles, como los andamios de polímeros, actúan como vehículos de entrega intracelular convenientes para proteínas, ya que ofrecen flexibilidad de diseño a través de la diversidad química. Por ejemplo, se han utilizado fluoropolímeros catiónicos o dendrímeros para lograr el suministro de proteínas citosólicas para aplicaciones amplias, como la edición de genes terapéuticos y la inmunoterapia contra el cáncer.

Estudios previos han demostrado la entrega directa de proteínas citosólicas utilizando proteínas codiseñadas modificadas con «E-tags» terminales de oligo (glutamato) y nanopartículas de oro funcionalizadas con guanidinio. Recientemente, la estrategia para los polímeros de poli(oxanorborneno)imida (PONI-guan) funcionalizados con guanidinio se ha adaptado para lograr un suministro citosólico altamente eficiente. Sin embargo, ambas estrategias requieren la ingeniería de plásmidos para obtener proteínas etiquetadas con E que difieren de las proteínas nativas, lo que hace que estas estrategias sean engorrosas.

Nueva estrategia propuesta para la entrega de proteínas citosólicas

La unión tetravalente de biotina-estreptavidina (STV) proporciona una estrategia modular de alta afinidad para la bioconjugación de proteínas. Se pueden biotinilar varios sistemas macromoleculares y moleculares, lo que convierte al STV en una plataforma extremadamente versátil para la bioconjugación de proteínas.

En este estudio, los investigadores utilizaron matrices modulares de nanocompuestos de estreptavidina-biotina para lograr la entrega citosólica de proteínas. Inicialmente, las proteínas biotiniladas, incluida la proteína fluorescente verde biotinilada (b-GFP) y el oligo(glutamato) biotinilado (b-E20), se conjugaron con STV.

A continuación, los conjugados se autoensamblaron utilizando homopolímero de PONI-guan para obtener nanocompuestos de proteína-polímero supramoleculares discretos. GFP se ha utilizado como proteína modelo debido a su capacidad de difundirse pasivamente en el núcleo y su fuerte fluorescencia. Por lo tanto, puede proporcionar una indicación clara del acceso citosólico.

Síntesis, caracterización y evaluación de proteínas biotiniladas y nanocompuestos

b-GFP se sintetizó mediante el entrecruzamiento reactivo con amina de GFP de tipo salvaje a través del acoplamiento de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). b-E20 y proteínas biotiniladas adicionales también se sintetizaron de manera similar a b-GFP.

Los nanocompuestos de polímero PONI-guan/STV/b-E20/b-GFP se sintetizaron en tubos de microcentrífuga de polipropileno. Primero, se pipeteó STV en una mezcla de b-GFP y b-E20 y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante diez minutos. A continuación, se añadió homopolímero de PONI-guan a la mezcla de nanocompuestos y la mezcla se incubó de nuevo durante diez minutos a temperatura ambiente para obtener los nanocompuestos finales de polímero de PONI-guan/STV/b-E20/b-GFP.

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para caracterizar las muestras sintetizadas, mientras que la entrega citosólica y el acceso nuclear efectivo de b-GFP se cuantificaron mediante citometría de flujo de imágenes. Se utilizaron espectrometría de masas de ionización por electropulverización e imágenes de microscopía confocal para verificar la biotinilación y evaluar el suministro citosólico por fluorescencia, respectivamente.

Además, se utilizó un ensayo de desplazamiento colorimétrico del ácido 4′-hidroxiazobenceno-2-carboxílico (HABA) para confirmar la unión entre b-E20, b-GFP y STV. Finalmente, la retención de la función de la proteína después del suministro citosólico se evaluó mediante el suministro de granzima A biotinilada (b-GrA), una enzima quimioterapéutica.

resultados del estudio

Los nanocompuestos PONI-Guan/STV/b-E20/b-GrA se sintetizaron con éxito con un tamaño promedio entre 200 nanómetros y 350 nanómetros. El ensayo de competición HABA confirmó la unión entre las proteínas y STV. Todos los nanocompositos tenían una morfología esférica y un tamaño similar.

Los nanocompuestos lograron un suministro citosólico efectivo de proteínas b-GFP tanto en adenocarcinoma cervical humano como en células epiteliales de ovario de hámster. Además de b-GFP, también se logró un suministro citosólico eficaz para las proteínas adicionales, lo que demuestra la estrategia de anclaje basada en biotina-estreptavidina para el suministro de proteínas intracelulares.

Se observó fluorescencia verde difusa en todo el citosol en microscopía confocal, lo que indica desprendimiento citosólico. La liberación citosólica de la proteína se produjo entre tres y cinco horas después de la incubación inicial de los nanocompuestos. No se observaron toxicidad significativa ni cambios en la morfología celular después de la incubación.

La retención de la función de la proteína después del suministro citosólico se confirmó mediante la destrucción eficaz de las células después del suministro de GrA. La entrega citosólica de GFP mostró una mayor eficiencia cuando los nanocompuestos se utilizaron como vectores de entrega en comparación con los reactivos de entrega de proteínas disponibles en el mercado.

En resumen, los resultados de este estudio demostraron que los nanocompuestos PONI-Guan/STV/b-E20/b-GrA representan un enfoque versátil y modular para la administración de proteínas intracelulares a través de la unión no covalente de múltiples componentes a un único vehículo de administración.

referencia

Goswami R, Gopalakrishnan S, Nagaraj H. et al. (2022) Transporte de proteínas citosólicas mediante ensamblaje modular de biotina-estreptavidina de nanocompuestos. ACS nano. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c06768

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